بررسی ماندگاری کیت ژنوپرایم
- بزاق یک مایع مفید بدن جهت اهداف تشخیصی و تحقیقاتی است. نمونهگیری بزاق یک روش غیر تهاجمی است و از DNA ﺟﺪا ﺷﺪه از ﺑﺰاق ﻣﯽﺗﻮان ﺑﺮای غربالگری، تشخیصِ بیوﻣﺎرﮐﺮﻫﺎی ﺳﺮﻃﺎنی و خود ایمنی و تعیین ساختار ژنتیکی استفاده کرد.
- مقدار DNA در بزاق از نمونهای به نمونه دیگر بسیار متغیر است. مقدار DNA موجود در بزاق تحت اثر عوامل متفاوتی از جمله وضعیت سلامتی فرد است. سن، جنس و وضعیت ایمنی نیز میتواند بر سلولهای اپیتلیال موجود در بزاق تاثیر بگذارد. در نتیجه، میتوان انتظار داشت برخی نمونهها حاوی غلظت بالایی از DNA و برخی دیگر غلظت DNA پایینی داشته باشند. بنابراین، ایدهآلترین محلول نگهدارنده DNA بزاق باید سازگار و قابل اعتماد باشد و بالاترین بازده DNA را از همه نمونهها، از جمله نمونههایی که حاوی مقادیر بسیار کمی DNA هستند، ارائه دهد.
مواد و روشها
- نمونهگیری
دو میلیلیتر بزاق از 5 نفر گرفته شد. تمام نمونهها در کیت نگهداری “ژنوپرایم” جمعآوری شده و در شرایط یکسان به مدت 10 روز در دمای اتاق نگهداری شد و سپس به صورت همزمان استخراج شدند.
- استخراج DNA از بزاق
جداسازی DNA از بزاق با کیت E.Z.N.A Tissue DNA kit (D3396-02) طبق دستورالعمل سازنده کیت انجام شد. نمونههای بزاق به مدت 5 دقیقه و با سرعت 4000RPM در دستگاه سانتریفیوژ، رسوبگیری شدند. سپس مقدار 200µL از رسوب به میکروتیوب جدید انتقال داده شد. 20µL پروتئیناز K به نمونه اضافه شد و نمونهها در دمای 65 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه انکوبه شدند.
سپس به عنوان محلول اتصال، 200µL اتانول اضافه شد. محلول های شستشو را طبق دستورالعمل کیت اضافه کرده و در نهایت DNA جداسازی شده در 100µL محلول Elution کیت استخراج نگهداری شد.
- طیف نور سنجی
نمونههای استخراج شده با دستگاه Thermo Fisher Scientific NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometers از نظر کمی و کیفی اندازهگیری شدند.
- نتیجه
استفاده از بزاق به طور پیوسته در حال افزایش است، زیرا جمعآوری آن آسان و غیر تهاجمی است. در این مطالعه، بزاق از 5 شرکتکننده مختلف جمعآوری شد و در کیت نگهدارنده بزاق “ژنوپرایم” نگهداری شد. سپس DNA از تمام نمونهها با استفاده از کیت E.Z.N.A Tissue DNA kit جدا شد. برای تعیین بازده DNA جدا شده از همه نمونهها، خوانش اسپکتروفتومتری با استفاده از NanoDrop One Microvolume UV-Vis گرفته شد. نتیجه طیفسنجی غلطت 50-300 ng/µL را نشان داد.
جهت بررسی DNA استخراج شده نمونهها بر روی ژل آگارز 1/5X تست شدند. (تصویر 1)
بررسی ماندگاری کیت پس از 9 ماه
- در این بررسی 2 نمونه بزاق به مدت 9 ماه در دمای اتاق نگهداری شد. سپس با توجه به پروتکل کیت E.Z.N.A Tissue DNA kit (D3396-02) استخراج DNA انجام شد. برای بررسی غلظت DNA از روش طیف سنجی به وسیله دستگاه Thermo Fisher Scientific NanoDrop One Microvolume UV-Vis استفاده شد. (تصویر 2)
- برای سنجش کیفیت DNA از ژل اگارز 1/5X استفاده شد
- DNA ژنومی به تنهایی بررسی شد (تصویر 3)
در این تصویر 3µL نمونه DNA همراه با 1µL Loading dye مخلوط شده است.
- در مرحله دوم با نمونه استخراج شده، multiplex PCR انجام شد و نتیجه آن بر روی ژل آگارز 1/5X بررسی شد. (تصویر 4)
نتیجه گیری
- میتوان از کیت نمونهگیری "ژنوپرایم" برای نمونهگیری بزاق و انجام تستهای ژنتیک استفاده کرد.
- با توجه به آزمایشات انجام شده بر روی کیت نمونهگیری "ژنوپرایم"، DNA استخراج شده از بزاق غلظت مناسبی جهت انجام تستهای تحقیقاتی و تشخیصی دارد.
- .
- کیتهای "ژنوپرایم" DNA با کیفیت مناسب ارائه میدهند که میتوان از آن در تستهای با حساسیت بالا استفاده کرد.
- با توجه به ct و نسبت 260/280 بررسی شده، DNA نگهداری شده در کیت "ژنوپرایم" دارای کیفیت بالایی بوده و میتوان از آن برای تستهای با حساسیت بالا استفاده کرد. نتایج تست Multiplex PCR هم نشان دهنده خلوص بالای DNA است.
- .
- DNA استخراج شده از کیت "ژنوپرایم" عاری از مواد مهارکننده PCR است.
- با توجه به تست Multiplex PCR انجام شده، DNA استخراج شده بدون مواد مهار کننده بوده و PCR کامل انجام شده است.
- .
- کیت نمونهگیری "ژنوپرایم" توانایی نگهداری DNA موجود در بزاق تا مدت زمان 9 ماه، در دمای اتاق را دارد.
- کیت نمونهگیری "ژنوپرایم" به مدت 9 ماه در دمای اتاق نگهداری شد و سپس با استفاده از کیت استخراج E.Z.N.A Tissue DNA kit (D3396-02) فرایند استخراج DNA انجام شد. در بررسیهای انجام شده نمونه DNA کیفیت مطلوبی داشته و در آزمایش PCR نیز به خوبی عمل کرده است.
- .
- میتوان از کیتهای "ژنوپرایم" برای انجام تستهای ژنتیک بدون نیاز به مراجعه حضوری استفاده کرد.
- به علت روش نمونهگیری ساده و آسان، متقاضیان به راحتی میتوانند در خانه نمونه گیری را انجام دهند.