بررسی ماندگاری کیت ژن و پرایم
- بزاق یک مایع مفید بدن جهت اهداف تشخیصی و تحقیقاتی است. نمونه گیری بزاق یک روش غیر تهاجمی است و از DNA ﺟﺪا ﺷﺪه از ﺑﺰاق ﻣﯽ ﺗﻮان ﺑﺮای غربالگری، تشخیص بیوﻣﺎرﮐﺮﻫﺎی ﺳﺮﻃﺎنی و خود ایمنی و تعیین ساختار ژنتیکی استفاده کرد.
- مقدار DNA در بزاق از نمونه ای به نمونه دیگر بسیار متغیر است. مقدارDNA موجود در بزاق تحت اثر عوامل متفاوتی از جمله وضعیت سلامتی فرد است. سن،جنس و وضعیت ایمنی نیز می تواند بر سلول های اپیتلیال موجود در بزاق تاثیر بگذارد. در نتیجه، می توان انتظار داشت برخی نمونه ها حاوی غلظت بالایی از DNA و برخی دیگر غلظت DNA پایینی داشته باشند. بنابراین، ایده آل ترین محلول نگه دارنده DNA بزاق باید سازگار و قابل اعتماد باشد و بالاترین بازدهDNA را از همه نمونه ها، از جمله نمونه هایی که حاوی مقادیر بسیار کمی DNA هستند، بگیرد.
مواد و روش ها
- نمونه گیری
دو میلی لیتر بزاق از 5 نفر گرفته شد. تمام نمونه ها در کیت نگهداری “ژن و پرایم” جمع آوری شده و در شرایط یکسان به مدت 10 روز در دمای اتاق نگهداری شد و سپس به صورت همزمان استخراج شدند.
- استخراج DNA از بزاق
جداسازی DNA از بزاق با کیت E.Z.N.A Tissue DNA kit (D3396-02) طبق دستورالعمل سازنده کیت انجام شد. نمونه های بزاق به مدت 5 دقیقه و با سرعت 4000RPM در دستگاه سانتریفیوژ، رسوب گیری شدند. سپس مقدار 200µL از رسوب به میکروتیوب جدید انتقال داده شد. 20µL پروتئیناز K به نمونه اضافه شد و نمونه ها در دمای 65 درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه انکوبه شدند.
سپس به عنوان محلول اتصال، 200µL اتانول اضافه شد. محلول های شستشو را طبق دستورالعمل کیت اضافه کرده و در نهایت DNA جداسازی شده در 100µL محلول Elution کیت استخراج نگهداری شد.
- طیف نور سنجی
نمونه های استخراج شده با دستگاه Thermo Fisher Scientific NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometers از نظر کمی و کیفی اندازه گیری شد
- نتیجه
استفاده از بزاق به طور پیوسته در حال افزایش است، زیرا جمع آوری آن آسان و غیر تهاجمی است. در این مطالعه، بزاق از 5 شرکت‌کننده مختلف جمع‌آوری شد و در کیت نگهدارنده بزاق “ژن و پرایم” نگهداری شد. سپس DNA از تمام نمونه‌ها با استفاده از کیت E.Z.N.A Tissue DNA kit جدا شد. برای تعیین بازده DNA جدا شده از همه نمونه ها، خوانش اسپکتروفتومتری با استفاده از NanoDrop One Microvolume UV-Vis گرفته شد. نتیجه طیف سنجی غلطت 50-300 ng/µL را نشان داد.
جهت بررسی DNA استخراج شده نمونه ها بر روی ژل آگارز 1/5X تست شدند. (تصویر 1)
بررسی ماندگاری کیت پس از 9 ماه
- در این بررسی 2 نمونه بزاق به مدت 9 ماه در دمای اتاق نگهداری شد. سپس با توجه به پروتکل کیت E.Z.N.A Tissue DNA kit (D3396-02) استخراج DNA انجام شد. برای بررسی غلظت DNA از روش طیف سنجی به وسیله دستگاه Thermo Fisher Scientific NanoDrop One Microvolume UV-Vis استفاده شد. (تصویر 2)
- برای سنجش کیفیت DNA از ژل اگارز 1/5X استفاده شد
- DNA ژنومی به تنهایی بررسی شد (تصویر 3)
در این تصویر 3µL نمونه DNA همراه با 1µL Loading dye مخلوط شده است.
- در مرحله دوم با نمونه استخراج شده، multiplex PCR انجام شد و نتیجه آن بر روی ژل آگارز 1/5X بررسی شد. (تصویر 4)
نتیجه گیری
- می توان از کیت نمونه گیری "ژن و پرایم" برای نمونه گیری بزاق و انجام تست های ژنتیک استفاده کرد.
- با توجه به آزمایشات انجام شده بر روی کیت نمونه گیری "ژن و پرایم"، DNA استخراج شده از بزاق غلظت مناسبی جهت انجام تست های تحقیقاتی و تشخیصی دارد.
- .
- کیت های "ژن و پرایم" DNA با کیفیت مناسب ارائه می دهد که می توان از آن در تست های با حساسیت بالا استفاده کرد.
- با توجه به ct و نسبت 260/280 بررسی شده، DNA نگهداری شده در کیت "ژن و پرایم" دارای کیفیت بالایی بوده و می توان از آن برای تست های با حساسیت بالا استفاده کرد. نتایج تست multiplex PCR هم نشان دهنده خلوص بالایDNA است.
- .
- DNA استخراج شده از کیت "ژن و پرایم" عاری از مواد مهار کننده PCR است.
- با توجه به تست multiplex PCR انجام شده، DNA استخراج شده بدون مواد مهار کننده بوده و PCR کامل انجام شده است.
- .
- کیت نمونه گیری "ژن و پرایم" توانایی نگهداری DNA بزاق تا مدت زمان 9 ماه را دارد.
- کیت نمونه گیری "ژن و پرایم" به مدت 9 ماه در دمای اتاق نگهداری شد و سپس با استفاده از کیت استخراج E.Z.N.A Tissue DNA kit (D3396-02) فرایند استخراج DNA انجام شد. در بررسی های انجام شده نمونه DNA کیفیت مطلوبی داشته و در آزمایش PCR نیز به خوبی عمل کرده است.
- .
- می توان از کیت های "ژن و پرایم" برای انجام تست های ژنتیک بدون نیاز به مراجعه حضوری استفاده کرد.
- به علت روش نمونه گیری ساده و آسان، متقاضیان به راحتی می توانند در خانه نمونه گیری را انجام دهند.